核酸的定量主要采用紫外分光光度法及电泳比较法。组成核酸分子的碱基,均具有一定的吸收蜾圃秒干紫外线特性,最大吸收值为250~270nm之间。例如腺嘌呤的最大紫外线屑枯扔羟吸收值在260.5nm,胞嘧啶:267nm,鸟嘌呤:276nm,胸腺嘧啶:264.5nm,尿嘧啶:259nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后,其最大吸收峰不会改变,但核酸的最大吸收波长是260nm,吸收低谷在230nm,这个物理特性为测定核酸溶液度提供了基础。在260nm波长紫外光下,1A值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml;单链DNA或RNA为40μg/ml;单链寡核苷酸为20μg/ml。可以由此计算核酸样品的浓度(紫外分光光度法)。质粒DNA及微量DNA片段的浓度还可以通过与已知浓度的DNA标准同时进行电泳,根据其结合的溴乙锭荧光强度,估计其样品的浓度(电泳法)。
工具/原料
仪器与器材1.紫外分光光度计,微量石英比色皿2.电泳仪,电泳槽,紫外灯。
试剂1.6×点样缓冲液:0.25%溴酚兰、40%蔗糖2.DNA分子量标准:λDNA漆虱忧甘/HindⅢ3.50×TAE电泳缓冲液贮存液配方:(50×)每升242gTris,57.1ml冰忧腐刖盂醋酸,100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)1×缓冲液浓度:0.04mol/LTris-HAc、0.002mol/LEDTA4.0.8%琼脂糖凝胶:0.8g琼脂糖用100ml1×TAE沸水浴溶解5.10mg/mlEB:1.0g溴乙锭100ml三蒸水
方法/步骤
1、(一)紫外分光光度法:略。
2、(二)琼脂糖凝胶电泳比较法:若DNA样品中含RNA或其它杂质,凝胶电泳是一种方便而较准确的定量方法。
3、1.取2μlDNA样品,加0.4μl电泳上样缓冲液(含溴酚蓝),混匀后加样于含0.5μg/ml溴乙锭的琼脂糖微型电泳凝胶的孔格内。
4、2.取一系列浓度不同的2μl标准DNA样品(0.5~50μg/ml)0.4μl上样缓冲液混合上样。标准DNA溶液中,应含有一种与样品DNA分子量大小相近似的DNA分子。
5、3.电泳:使DNA移入琼脂糖胶内。一般为溴酚蓝迁移2cm左右。
6、4.将凝胶浸入含0.01mol/LMgCl2的电泳缓冲液中5分钟,进行背景脱色。
7、5.在短波紫外线(254nm)下进行拍照,比较样品DNA与DNA的标准品的荧光强度,并计算出待测样品中DNA浓度。荧光法灵敏快速。但它的荧光强度决定于溴乙锭嵌入碱基中的多少,这与DNA的超螺旋程度密切相关,标准与样品难以完全一致,并且还受其它影响荧光发光污染物的影响。