最近小编收到很多问题，其中一个就是下面小编为大家整理一下关于SMART-RACE技术获得Pm-cycinY的eDNA方法的步骤，希望这些方法能够帮助到大家。
方法/步骤
1、首先，通过逆转录以提取的斑节对虾总RNA为模板，参考SMARTMRACE试剂盒中的逆转录方法合成cDNA第条链。
2、然后，将得到的cDNA模板经B-actin通用引物检测，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测显示条带清亮且无杂带，然后进行分装，80C保存，备用。1.3.2Pm-cyelinY的分子克隆通过对斑节对虾转录组数据筛选获得cyclinY的基因片段。
3、然后，用Primer5.0软件设计特异性引物F(5'-TGGGCAACAAACAC-3)和R(S'-GCTATTCTGTCATGATCTTG-3)。以cDNA为模板，对该序列进行验证，经Blast比对，获得开放阅读框序列ORF。
4、然后，采用cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplificationofc锓旆痖颧DNAEnds,RACE)扩增Pm-cyclinY的cDNA鹚兢尖睁的5'和3末端。利用半巢式(semi-nested)PCR方法，首先由GSP1(3'GSP1:5'-ATCAATGTGCCGTCCTCTGTGTATG-3'和5'GSPI:5'-TCAGGACCCCAGTCTTCACCCAACA-3)和Adaptorprimer(接头引物UPM)进行降落PCR反应。
5、然后，将所得PCR产物稀释100倍，取1μL作为模板，利用引物GSP2(3&#补朱锚卦39;GSP2:5'稆糨孝汶;-GCAGAACAGTTATGCCGTAATGGTC-3‘和5'GSP2:5'-TGTGTTTATCCTGGGGGAAGGTCGG-3)和NUP再进行PCR扩增。PCR反应体系为:10xBuffer反应缓冲液2.5μL,10mmol/LdNTP0.5μL，UPM2.5μ，1000UExTaq酶0.5μL,1μLcDNA模板。
6、最后，用双蒸水将反应体系补充至25.0μL，反应条件为:94C变性4min;94'C，30s.68C，30s,72C,2min,30个循环;72C延伸10min。
